01  非生物風(fēng)化

80℃黑暗中風(fēng)化6個(gè)月后，LDPE塑料顆粒氧化變成橙黃色，通過FITR檢測發(fā)現(xiàn)出現(xiàn)羰基峰，分子量也減小。風(fēng)化引起解聚，聚合物氧化鏈會(huì)斷裂。相比于原始的LDPE塑料，風(fēng)化后的塑料產(chǎn)生大量溶解碳，如圖1所示。

圖1  原始和風(fēng)化聚乙烯的非生物風(fēng)化和碳浸出

02  在原始和風(fēng)化PE中孵化時(shí)的生長

分別在含琥珀酸、原始LDPE 、風(fēng)化LDPE和不添加碳源的培養(yǎng)基中接種Alcanivorax sp. 24，令人驚訝的是，從風(fēng)化PE中浸出的約180 ppm碳（從圖1c推斷的數(shù)據(jù)）誘導(dǎo)的初始生長速率高于不穩(wěn)定基質(zhì)琥珀酸鹽。然而，隨著時(shí)間的推移，由于琥珀酸鹽條件下可獲得1200 ppm的碳，Alcanivorax sp.24實(shí)現(xiàn)了預(yù)期的更高細(xì)胞產(chǎn)量。無碳或原始LDPE顆粒的生長可以忽略不計(jì)（圖2b）。

Alcanivorax sp.24在存在原始PE和風(fēng)化PE的情況下生長，獲得了塑料的同位素特征，證實(shí)該菌株不僅能夠吸收風(fēng)化PE的滲濾液，而且能夠從原始PE中獲得碳。Alcanivorax 的同位素特征（δ¹³C）來自于與原始和風(fēng)化的IAEA-CH-7 PE膜孵育七天的培養(yǎng)物（即檢查其同位素均勻性的材料，δ¹³C值為?32.15‰±0.05‰）。用琥珀酸和無碳源培養(yǎng)的細(xì)胞作為對照。以化石燃料為基礎(chǔ)的材料，如聚乙烯，因其¹³C耗盡而聞名，因此其δ¹³C值低于?30‰，而從C₄植物中獲得的琥珀酸鹽的¹³C含量更高，δ¹³C值在?13‰左右。在原始PE和風(fēng)化PE中生長的Alcanivora 的同位素值與標(biāo)準(zhǔn)PE材料的同位素值幾乎相同，表明細(xì)胞獲得了塑料的同位素¹³C:¹²C比（圖2c）。正如預(yù)期的那樣，在琥珀酸鹽存在下生長的Alcanivorax 的δ¹³C特征不那么負(fù)（?16‰）。從沒有添加碳的培養(yǎng)物中提取的饑餓細(xì)胞似乎保留了它們最初使用的基質(zhì)的同位素比例。

圖2  Alcanivorax sp.24在原始和風(fēng)化PE上的生長

03  降低原始LDPE的質(zhì)量和聚合物分子量分布

鑒于意外觀察到Alcanivorax 獲得了原始PE的同位素特征，我們進(jìn)一步研究了該細(xì)菌是否能夠?qū)λ芰线M(jìn)行物理化學(xué)修飾。風(fēng)化和非風(fēng)化LDPE膜在Alcanivorax sp.24培養(yǎng)基中培養(yǎng)34天，然后測定質(zhì)量變化（圖3）和聚合物總分子量（表1）。

表1  在Alcanivorax sp.24存在和不存在的情況下培養(yǎng)34天的原始和風(fēng)化LDPE膜的聚合物分子量分布

有趣的是，Alcanivorax 使原始LDPE膜的中值質(zhì)量減少了約0.9%，而奇怪的是，對照組（即未接種和死細(xì)胞對照組）的中值質(zhì)量增加分別為約2.1%和約1.7%（圖3）。浸沒塑料的質(zhì)量增加并不意外，可以通過材料內(nèi)的膨脹水化和/或鹽沉積來解釋。風(fēng)化LDPE膜的平均質(zhì)量損失約為2.4%，與Alcanivorax 的存在無關(guān)（圖3）。該質(zhì)量損失與根據(jù)風(fēng)化聚乙烯釋放的溶解有機(jī)物（即約2%）計(jì)算的值一致，該值可能以微生物生物降解的現(xiàn)成低聚物的形式存在。Alcanivorax sp.24降低了原始LDPE的聚合物重量分布（表1）。細(xì)菌的存在將原始LDPE的分子量從122900減少到83500，將風(fēng)化LDPE的分子量從24100減少到20600。原始LDPE的Mn、Mw和Mz的還原率分別為20.1%、32.0%和44.7%，風(fēng)化LDPE的還原率分別為55.0%、14.7%和28.4%。這種廣泛的解聚作用再次表明Alcanivorax sp.24能夠?qū)υ己惋L(fēng)化的LDPE進(jìn)行物理化學(xué)改性。因此，初級PE生物降解的分子機(jī)制值得進(jìn)一步研究。

圖3  34天后，在Alcanivorax sp.24存在和不存在時(shí)的LDPE膜質(zhì)量變化

04  通過蛋白質(zhì)組分析法研究對PE存在的應(yīng)答

通過蛋白質(zhì)組學(xué)分析Alcanivorax sp.24對原始和風(fēng)化LDPE膜存在的分子反應(yīng)。分析包括浮游細(xì)胞和附著在PE上的生物膜，后者由于與基質(zhì)直接接觸，有望提供更強(qiáng)的信號。這一全面的蛋白質(zhì)組分析與Alcanivorax sp.24的蛋白質(zhì)組分析相輔相成，Alcanivorax sp.24生長在中鏈和長鏈烷烴（C₁₆；戊烷，C₂₅；戊烷，C₅₀）以及短鏈和中鏈二羧酸（即琥珀酸，C₄；十六烷基二酸，C₁₆）上，所有基質(zhì)都可能來自PE風(fēng)化。Hakkarainen和Albertson（Hakkarainen和Albertson, 2004）發(fā)現(xiàn)了200多種非生物PE氧化產(chǎn)生的脂肪族降解產(chǎn)物，Eyheraguibel及其同事（Eyheraguibel等人，2017）最近描述了1320種高度氧化的低聚物，即烷烴、烯烴、酮、醛、醇、羧酸和二羧酸、內(nèi)酯、酮酸和酯類。在這些脂肪族基質(zhì)中，羧酸最穩(wěn)定，因此在長時(shí)間的風(fēng)化過程中容易積累，而其他產(chǎn)物，如醛、酮和醇，則進(jìn)一步氧化為羧酸。條件之間的總體比較顯示，從不穩(wěn)定基質(zhì)到穩(wěn)定基質(zhì)存在梯度，即琥珀酸是最不穩(wěn)定的基質(zhì)，其次是烷烴C₁₆和C₂₅以及十六烷基二酸。在Alcanivorax 的更頑固的底物中，我們觀察到原始的PE和長烷烴C₅₀，其次是風(fēng)化的PE（其中浮游生物和生物膜生長的細(xì)胞的蛋白質(zhì)組非常緊密地分組）。在原始PE作為碳源的情況下，觀察到浮游生物和生物膜生長的細(xì)胞之間有更強(qiáng)的分化，這表明直接附著在PE上的細(xì)胞可能更容易接觸到這種頑固性基質(zhì)（圖4）。因此，PE作為異養(yǎng)細(xì)菌細(xì)胞碳源的可及性似乎受到PE熱氧化以及Alcanivorax 黏附在材料表面的強(qiáng)烈介導(dǎo)。

圖4  不同處理下生長的Alcanivorax sp.24產(chǎn)生的蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)的主成分分析

所有處理與琥珀酸鹽（對照）生長之間的比較蛋白質(zhì)組學(xué)使我們能夠確定Alcanivorax 用于特異分解中鏈和長鏈烷烴以及中鏈二羧酸（即十六烷基二酸）的細(xì)胞過程，并將其與菌株在原始和風(fēng)化PE中生長時(shí)的細(xì)胞反應(yīng)進(jìn)行比較。有趣的是，當(dāng)在中鏈和長鏈烷烴或十六烷基二酸存在下生長時(shí)，一些蛋白質(zhì)顯示出更高的豐度，但這些蛋白質(zhì)在PE處理中均上調(diào)（圖5），證實(shí)了Alcanivorax 編碼的代謝多功能性，以分解PE鏈氧化和斷裂產(chǎn)生的脂肪族化合物的復(fù)雜混合物。

05  烷烴氧化

羥基化是烷烴同化的第一步。短鏈和中鏈烷烴被烷烴單加氧酶AlkB末端羥基化。Alcanivorax sp.24編碼三種AlkB酶，即使在存在原始PE的情況下，其在大多數(shù)烷烴和PE處理中的表達(dá)也顯著增加。長鏈烷烴（例如C₅₀）的同化目前尚不清楚，有研究者假設(shè)長鏈烷烴的氧化可能在底物亞末端羥基化后完成，然后通過Baeyer-Villiger單加氧酶AlmA將亞末端羥基化烷烴轉(zhuǎn)化為酯，再由酯酶進(jìn)一步水解。有趣的是，AlmA在所有PE處理中表現(xiàn)出最強(qiáng)的增長，這可能是PE生成長鏈烷烴的結(jié)果。正如所料，在十六烷基二酸處理中未觀察到AlmA和AlkB酶豐度的增加，這表明這些途徑受到Alcanivorax sp.24中烷烴的存在的嚴(yán)格調(diào)控。

圖5  Alcanivorax sp.24用于攝取和降解脂肪族底物的代謝途徑模型

06  脂肪酸降解模型

羥基化烷烴進(jìn)一步氧化為脂肪酸，并通過β-氧化途徑降解。圖5顯示大量脂肪酸降解酶分配給某些底物組的嘗試：以脂肪酸形式漏斗狀排列的中型和大型烷烴，以及中型二羧酸。有趣的是，這些酶在PE處理中均上調(diào)，另外一組酶僅在塑料存在時(shí)上調(diào)，作者認(rèn)為它們參與降解更復(fù)雜的脂肪族化合物，例如不飽和和亞末端氧化以及支鏈、奇數(shù)和大脂肪酸。因此，PE降解產(chǎn)生的產(chǎn)物最終轉(zhuǎn)化為醋酸鹽，并進(jìn)入TCA循環(huán)，用于碳同化和能量生成。

07  初級PE鏈斷裂

與短鏈和中鏈烷烴不同，長鏈和超長鏈烷烴（如PE中的烷烴）的生物結(jié)合似乎是不現(xiàn)實(shí)的，聚合物鏈斷裂是跨生物膜運(yùn)輸所必需的。雖然形成PE主鏈的C-C鍵高度穩(wěn)定且無反應(yīng)，但PE氧化會(huì)產(chǎn)生較弱的酶斷鏈位點(diǎn)。脂肪族化合物的存在誘導(dǎo)了Alcanivorax sp. 24中脂肪酶和水解酶的上調(diào)。雖然大多數(shù)水解酶（即ALC24_0035、1429、1581、2299和4209）被預(yù)測為細(xì)胞質(zhì)，因此可能在進(jìn)口低聚物的生物降解中發(fā)揮作用，但酶ALC24_1162、2550和3988可能分泌到周質(zhì)或外膜，在那里它們可以水解氧化的PE鏈，降低其分子量并促進(jìn)其生物同化（圖5）。

08  產(chǎn)生氧化LDPE膜表面的細(xì)胞外活性氧

眾所周知，海洋微生物可產(chǎn)生細(xì)胞外活性氧，尤其是超氧化物（推測是引發(fā)PE鏈斷裂和降解的主要途徑）。因此，我們測量了Alcanivorax sp.24在不同底物存在下生長14天后產(chǎn)生的細(xì)胞外活性氧（圖6a）。有趣的是，雖然在大多數(shù)情況下，在最初24小時(shí)的培養(yǎng)過程中觀察到超氧物生成的峰值，但在整個(gè)兩周的培養(yǎng)過程中，原始LDPE誘導(dǎo)Alcanivorax 產(chǎn)生的ROS較低但延長了很多（圖6a）。經(jīng)風(fēng)化PE培養(yǎng)后，超氧物的生成水平可以忽略不計(jì)，這可能是由于細(xì)菌產(chǎn)生的ROS較低，或由于塑料滲濾液可能具有猝滅作用，即與超氧物快速反應(yīng)，不允許其氧化熒光素報(bào)告物。

圖6  Alcanivorax sp.24培養(yǎng)物中ROS的產(chǎn)生和LDPE膜表面氧化

在用Alcanivorax 培養(yǎng)的原始LDPE膜中檢測到氧化峰（圖6b上的綠色箭頭）表明，細(xì)菌產(chǎn)生的活性氧實(shí)際上可能影響聚合物的物理化學(xué)。該氧化峰發(fā)生在熱氧化非生物誘導(dǎo)羰基形成的相同波數(shù)處。

09  總 結(jié)

總之，我們的數(shù)據(jù)為PE生物降解提供了關(guān)鍵的新見解。Alcanivorax sp.24在分解PE降解產(chǎn)生的脂肪族基質(zhì)的復(fù)雜混合物方面表現(xiàn)出令人印象深刻的代謝潛力，當(dāng)細(xì)菌暴露于風(fēng)化和原始PE時(shí)觀察到這一點(diǎn)。這種代謝途徑的誘導(dǎo)以及塑料同位素特征的獲得表明，細(xì)菌可以有效地利用從這種材料中滲出的少量基質(zhì)，或其本身可以引發(fā)原始PE的鏈斷裂，即，如所測試的原始和風(fēng)化LDPE材料的質(zhì)量損失和廣泛解聚所示，原始PE的主鏈斷裂可能通過細(xì)胞外活性氧的產(chǎn)生和高分子量PE聚合物的非特異性鏈內(nèi)氧化發(fā)生。需說明的是該研究是在最佳的實(shí)驗(yàn)室條件下進(jìn)行的純菌培養(yǎng)，無法確定復(fù)雜生物和換幾個(gè)是否會(huì)對碳?xì)浠衔锏慕到猱a(chǎn)生影響，還需進(jìn)一步的研究證實(shí)。